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第六章 DNA的复制、修复和重组
细胞在复杂多变的环境中维持生命活动的秩序是依赖于DNA所携带的大量遗传信息的准确复制，这种复制过程被称为DNA复制。这个过程必须发生在一个细胞产生两个遗传学上完全相同的子代细胞之前，在细胞中维持秩序也需要对它的遗传信息进行不断地监督和修复，DNA易受来自环境中的化学药品和放射物的损害，也易受细胞内产生的活性分子的损害。在这一章中，我们讲述细胞中用于DNA复制和修复的蛋白质机器，这些蛋白质机器催化一些细胞内发生的快速而精确的过程。
尽管这些系统能保护遗传物质以防止发生复制错误和偶然的损害，但永久的改变或突变有时也会发生。尽管许多突变不会以任何显著的方式影响生物体，但有一些也有意义深远的影响，有时候，这些改变有益于生物体：例如突变能是细菌对用来杀死它们的抗菌素产生抵抗力。实际上，在DNA中这些改变的积累已超过数百万年，因而使遗传物质多样化，使一个物种与另一个物种截然不同。突变也可产生小的变异，这些变异可造成同一物种中不同个体间的许多差异。这我们可在人类和其他动物中很容易看到遗传信息从一代忠实的传到下一代。DNA的差异能产生变异，这种变异构成同一物种不同个体间的差异，久而久之，一个物种和其他的物种间形成差异。在一个家庭中，小孩间会长的比较像，这是由于他们遗传了他们父母的特有的基因。猫和人类有许多相同的特征，但经过数百万年的进化，使人和猫分开，这些遗传变化现在是我们和猫成为不同的物种。鸡是与我们亲缘关系更远的动物。然而，突变也是有害的：在人类中，他们引起几千种遗传疾病和许多类型的癌症。因此，一个细胞或一个生物体的存活取决于是否能将DNA的变化保持在最小值。如果没有不断地监督和修复受损DNA的细胞系统，生命就可能不存在。
我们通过学习这些负责复制和使DNA维持在最小变化的机制来开始学习这一章。
第一节 DNA复制
在每次细胞分裂中，细胞必须非常精确的复制它的基因组，在这一节中，我们将学习一下细胞如何完成它的工作，以每秒1000核苷酸的高速率复制DNA。
一、碱基配对使DNA复制
在前面的章节中，我们看到每股DNA双螺旋结构都包含两条核苷酸链，它们是准确互补配对的。每条链都可以作为一条新互补链合成的模板。图6-2，一条DNA链可作为模板，结合优先发生在能形成碱基对的核苷酸间（A与T,G与C），每一条链都可作为模板合成与它互补的链。
换句话说，如果我们指定两条DNA链分别为S和S’，S链可作为模板合成一条新的S’链，而S’链也可以作为模板合成一条新的S链。图6-3，DNA作为自身复制的模板。双螺旋结构中的每条DNA链都可合成它的互补链特定核苷酸序列的模板。
DNA中的遗传信息通过这种简单的过程就可以得到精确的复制。链S从链S’上分离，然后每个分开的DNA链有各自作为模板合成另一条新的互补链，这条互补链和先前与它配对的链核苷酸序列相同。
一个DNA分子的每条链作为合成其互补链的模板，这使细胞得到复制，它的基因也通过DNA复制传给后代。在一次细胞分裂中，涉及复制数万亿的核苷酸对，这种复制过程必须快速而准确的进行。这项工作是由一群蛋白质聚集在一起形成的复制机器来完成的。
DNA复制从母本DNA分子产生两个完整的双螺旋，除了稀少的复制错误外，每个新的DNA双螺旋结构在核苷酸序列上与母本DNA双螺旋完全相同。因为每条母本DNA链作为一条新链合成的模板，每个子代DNA双螺旋都包含一条母本DNA链和一条新合成的链，这种复制方式被称为半保留复制。图6-4，在每轮复制中，DNA中的每条链都作为合成其互补链的模板。原DNA链通过许多代细胞，仍能保持完整，DNA是半保留复制的，因为每个子代DNA双螺旋都由一条来自母本DNA的链和一条新合成的链组成。在P200-P202，How we know？中我们看一下第一次用来描述DNA以半保留复制方式复制的实验。
在1953年，Watson 和Crick发表了描述DNA结构模型的一篇著名文章。如图5-2。在这篇文章中，他们提到了互补碱基—A和T、G和C—顺着双螺旋结构的中心互补配对，使这两条DNA链紧密地结合在一起。接着他们又通过这种特殊的配对方式提出了遗传物质的一种可能的复制机制。
一个月后，这篇著名的文章发表在Nature杂志上，Watson 和Crick提出DNA可能是如何复制的。在这篇文章中，提出：双螺旋结构的两条链解开，每条链都作为模板，合成与它互补的子链。在他们的模型中，把这种复制方式称为半保留复制，每个新DNA 分子是由一条原母本链和一条新合成的链组成。图6-6，对DNA复制作出的不同预测的三种模型。图6-6A，在半保留复制模型中，每条亲本DNA链都作为模板来合成一条新的子链。第一轮复制将产生两个杂合DNA分子，每一个杂合DNA分子都包含一条来自原母本的链和一条新合成的链。随后都一轮复制将产生两个杂合DNA分子和两个不包含原亲本DNA链的新DNA分子。
我们现在已经知道Watson 和Crick提出的DNA复制的模型是正确的。但起初这种模型并未被普遍地接受。尊敬的物理学家后来转变为遗传学家的Delbrück，作为其中的一人，他对此提出疑问：双螺旋结构的两条链，互相缠绕如此多次而扭成很长的一束，它可能在没有造成混乱的缠在一起的情况下解开DNA的两条链吗？Watson和Crick关于DNA打开的设想是DNA是像拉链一样解开的，而Delbrück认为这在物理上是不太可能的。
Delbrück提出，DNA是通过一系列的打断和重新聚合来进行的。DNA主链被打断成短片段，DNA复制发生在短片段上，在重新聚合前，这一短片段可能只有10个核苷酸大小。这种模型被称为分散复制。复制的结果是新DNA和旧DNA的混合物，每条链都是新DNA和旧DNA的混合，而不必解开DNA双链。图6-6B，在分散复制模型中，每代子链DNA都将包含母本DNA链和新合成的DNA片段。
然而，第三个阵营提出DNA复制是全保留的观点：母本DNA双螺旋将在复制后以某种方式保持完整，子代分子包含两条全新的DNA链。如图6-6C。
为了判断着三种模型哪种是正确的，Meselson和Stahl做了一个实验来展现新合成的DNA链的组成。Meselson很严肃的考虑了辨别旧蛋白和新蛋白间不同的方法，这种方法可能也可用于研究DNA。他与Stahi共同合作完成了这个实验，这个实验被称为生物学中最漂亮的实验。
他们通过培养两批大肠杆菌来开始实验，一批是用含15N氮源的培养基培养，另一批是用含14N氮源的培养基培养，培养基养分中的氮经过核苷酸合成进入核苷酸碱基，以这种方法进入生物体的DNA中。在这两种培养基中培养选拔数代后，研究者把细菌分别放入两个烧瓶中，一个的DNA含15N，而另一个的DNA含有14N。然后，Meselson和Stahl把细菌细胞打碎，把DNA装入含有高浓度氯化铯的离心管中，进行离心，氯化铯会形成一个浓度梯度，DNA分子在溶液中漂浮或下沉，平衡时，DNA分子位于周围盐浓度与它们的浮力浓度相同的位置。Meselson和Stahl发现他们能通过观察DNA在氯化铯梯度中的位置来区分含15N的DNA和含14N的DNA，因为含15N的DNA比含14N的DNA分子质量大，它们集中在接近离心管底部的位置。图6-7，氯化铯浓度梯度离心能使含15N的DNA和含14N的DNA分开细菌在分别含14N和15N的培养基中培养几代，DNA被分别标记，然后打碎细胞，把DNA装入含氯化铯盐溶液的离心管中，高速离心两天后，含15N的DNA和含14N的DNA集中在离心管的不同部位而区分开。
Meselson和Stahl一经建立了区分含15N的DNA和含14N方法，就开始着手测验关于DNA复制的各种假说。他们先在含15N的培养基中培养细菌，然后，将15N标记的细菌转移到含14N的培养基中培养。在实验开始时，所有DNA都用15N标记的，但随着细菌的分裂，新合成的DNA链是用14N标记的。然后，他们记录含14N的DNA的积累量，检测哪种假说最符合实验数据。经培养一代后，研究者发现母本的这些含15N的DNA消失了，而出现了一种密度介于15N-DNA和14N-DNA的新的DNA分子。图6-8，Meselson和Stahl实验的第一部分，排除了全保留复制模型。A，细菌在含14N的培养基中培养，离心后DNA分子位于离心管上方。B，在含15N的培养基中生长的细菌，离心后DNA分子位于离心管底部。C，把在含15N的培养基上培养的细菌转移到含14N的培养基中培养，离心后，产生一条介于两母本DNA间的带。这一实验结果可以排除全保留复制模型，但不能区分半保留复制和分散复制。因为全保留复制模型预测母本DNA将全为含15N的，而子代DNA含的氮将全为14N，半保留复制预测子代DNA将包含一条含15N的DNA链和一条含14N的DNA链，分散复制预测新合成的子代DNA是含15N的DNA和含14N的DNA的杂合分子，所以不能区分半保留复制和分散复制。
为了区分半保留复制和分散复制模型，Meselson和Stahl使DNA受到高温，而使两条DNA链间的氢键断开，使双螺旋结构被拆开而成为单链。当研究者在离心前对杂合分子加热后，他们发现DNA的一条链是含15N的，而另一条是含14N的，这进一步支持了半保留复制模型。如果分散复制模型是正确的话，每条子链都包含15N和14N，离心后，所有的DNA都将集中在中间浓度处。
这个实验也说明了Watson和Crick是正确的。事实上，这个结果被广泛而快速的接受，以至于在Meselson和Stahl发表这些数据前，教科书上就已经描述了这个实验。
二、DNA合成在复制起点开始
DNA双螺旋在正常情况下是非常稳定的：DNA的两股链通过碱基间大量的氢键牢固地结合在一起。只有提供充足的热能，才能使DNA链分开。为了用来作为复制的模板，首先要把双螺旋结构打开，两股DNA链打开，暴露出未配对的碱基。
DNA复制的过程通过最初结合到DNA上的初始蛋白结合到DNA上开始，撬开两条链，打开碱基间的氢键。图6-5，DNA双螺旋结构在复制起点处打开。复制的初始蛋白在复制起点处识别DNA序列。在局部打开双螺旋的两股链，暴露出单链来作为复制的模板。
虽然这些氢键共同地使DNA双螺旋变得非常稳定，但单独的一个氢键是比较弱的。一次使一段短的DNA链中的少数碱基对分开，不需要大量能量，在一些蛋白帮助下，在正常温度下就可以发生。
DNA首先被打开的地方被称作复制起点，它们通常有一段特点的核苷酸序列。在细菌、酵母菌这些简单的细胞中，复制起点大约包含100个核苷酸对；它们由用来吸引初始蛋白的DNA序列组成，而对于已经打开的链，DNA的延伸是很容易进行的。通过学习第五章，我们知道，A=T碱基对间形成两个氢键，G≡C碱基对见形成三个氢键，因此，富含A-T碱基对的DNA相对地比较容易分开，而且，A-T碱基对丰富的DNA序列通常位于复制起点。
一个细菌的基因组，通常包含在一个含有几百万个核苷酸对的环形DNA分子上，有一个单一的复制起点，人类的基因组，非常大，有大约10000个复制起点。在人类中，可以同时在许多地方开始DNA的复制，这样一个细胞在很短的时间内就能够复制它整个的基因组。
一旦一个初始的蛋白结合到DNA的复制起点上，复制起点处打开双螺旋结构，它就会吸引一群用于DNA复制的蛋白质。这些蛋白质组成一个蛋白机器，每一个蛋白都执行着特定的功能。
三、新DNA的合成发生在复制叉处
DNA复制过程中，包含一个Y形的接合点，我们称为复制叉。图6-9，在真核生物的染色体上在多复制起点外以相反的方向移开。这个电子显微镜照片显示了苍蝇早期胚胎的DNA复制。沿着DNA的这些课件的微粒是核小体，它们是由DNA缠绕蛋白质复合物而形成的。图1、2和3显示的是同一部分DNA分子，它们处在DNA复制的连续阶段。橙色的线代表亲本的DNA链，红的的代表新合成的DNA。
在这些复制叉处，复制机器沿着DNA链移动，打开双螺旋结构的两股链，每条链都作为模板合成新的子链。在每个复制起点外形成两个复制叉，它们从复制起点开始沿相反的方向移动，随着复制的移动，DNA双螺旋被打开。所以，把在细菌和真核生物染色体中的DNA复制称为双向复制。复制叉移动的非常快—在细菌中大约每秒1000个核苷酸对，在人类中，大约每秒100个核苷酸对。在人类（可以说在所有真核生物中）复制叉移动的速度比较慢，这可能是由于这些生物体中，DNA是通过更复杂的染色质来复制的。
DNA复制机器的核心是一种被称为DNA聚合酶的酶。这种酶用亲本DNA的一条链作为模板来合成新的DNA。这种酶催化DNA链的延长，通过正延长的这条DNA链的3’末端与新加入的核苷酸的5’磷酸基形成一个磷酸二酯键而使DNA链继续延长。
DNA合成的基本反应是：一个脱氧核糖核苷酸与一条多聚核苷酸链的3’-OH末端结合。所以新的DNA链的合成方向是5’→3’。核苷酸是以核苷三磷酸的形式参与反应，即将进入的这个脱氧核糖核苷酸和模板链间的碱基对配对，指导者在核苷酸序列上与模板链互补的新DNA链的形成。如图6-2。
DNA聚合酶催化话核苷酸结合到正延长的DNA链的3’-OH游离端。新进的这个核苷三磷酸断裂一个酸酐键（星号）释放大量的自由能。这些能量用于这个聚合反应。
在核苷三磷酸中，一个高能建的水解，使核苷酸单体连接到DNA链上，并释放一分子焦磷酸盐。DNA聚合酶把能量的释放和聚合反应连接起来。而焦磷酸盐进一步水解为无机磷酸，使聚合反应不可逆。
DNA聚合酶在每次增加一个新核苷酸到正延长的DNA链上后并不从DNA上分离下来，而是一直与DNA结合，沿着模板链逐步的移动，催化进行聚合反应。
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