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以Chelex 100为介质抽提DNA
近年来，DNA的分析技术已广泛地应用于肿瘤学的研究中。获取DNA的传统方法是以新鲜、-70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提而获取DNA。1987年，Fey等［1］首先用NP40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的DNA，用于Southern印迹分析。国内的一些学者［2,3］也用相似的方法，从骨髓涂片中提取到DNA。但这两种方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时。同时，需要在多个离心管之间转移，增加了标本间的交叉污染。由于PCR技术对DNA样品的纯度和分子量的要求相对较低：对微量的DNA即可扩增，且只需待扩增的靶序列完整即可，不要求高分子量。因此，部分降解的DNA均可作PCR检测。由于PCR有极高的敏感度，需严格控制标本间的交叉污染，同时为了适应血液系统恶性肿瘤标本来源的特点，我们通过与常规酚、氯仿提取DNA进行比较，以了解以Chelex 100为介质提取DNA对PCR的影响。
一、材料和方法
1.细胞：(1)细胞株：B-NHL细胞株-村林细胞。(2)外周血有核细胞：由健康志愿者提供。
2.DNA获取率比较：(1)将不同培养瓶中已培养的村林细胞混合；A组取10份，5 ml/份；B组取10份，0.5ml/份。(2)A组用酚、氯仿抽提DNA ：按Sambrook等［4］介绍的方法提取DNA。(3)B组用Chelex 100为介质提取DNA：将已培养定量的村林细胞加入Eppendorf管中，加去离子水1ml，间歇振荡30 分钟。15 000r/min离心5分钟，弃去上清液470 μl，加10% Chelex 100 170 μl，56℃温育30分钟。超速振荡15秒，沸水浴8分钟，15 000 r/min离心5分钟，上清液即为DNA模板［5］。(4)DNA定量：在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取DNA的吸光度(A，曾称光密度OD)值，换算出DNA的浓度和获得量：
DNA浓度(μg/ml)=OD260 ×50×稀释倍数
DNA获得量(μg)=DNA浓度×DNA溶液体积(5)统计学处理：采用两样本均数检验法进行检验。
［4］
3.PCR敏感性比较：(1)外周血有核细胞DNA的提取：按Sambrook等方法用酚、氯仿提取。(2)实验分组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA与外周血有核细胞DNA混合为A组；以酚、氯仿抽提的村林细胞DNA与外周血有核细胞DNA混合为B组，使村林细胞DNA含量分别为5%、1%、0.5%、0.3%、0.2%和0.1%。(3)PCR扩增：取1μgDNA，选用IgH基因重排引物，按Trainor等［6］方法进行Semi-nest扩增。(4)取PCR产物15 μl于8%聚丙烯酰胺凝胶200V电泳2小时，EB染色，紫外灯下观测，拍照。本实验重复3次。
4.PCR准确性的比较：(1)PCR扩增：分别以Chelex 100法和酚、氯仿法抽提的50ng DNA为模板，进行扩增，方法同前。(2)SSCP检测：按Yap等方法进行［7］。(3)银染：1%硝酸浸泡5分钟，去离子水冲洗2次；0.2%硝酸银浸泡3～5分钟，去离子水冲洗2次；3%无水碳酸钠显影至条带清晰而背景不至过深，10%乙酸浸泡5分钟，停止反应。风干后拍照。重复3次。
5.血红蛋白对PCR敏感性的影响：(1)以Chelex 100 为介质提取村林细胞DNA：方法同前。(2)用健康志愿者外周血10 μl，按以Chelex 100 为介质抽提DNA的方法和过程，对其进行处理。(3)用酚、氯仿抽提外周血有核细胞DNA：方法同前。(4)用微量紫外分光光度计测DNA的含量：方法同前。A组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核细胞DNA稀释。PCR扩增时模板加量分别为1 μg。B组：以Chelex 100为介质抽提的村林细胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核细胞DNA稀释。PCR扩增时的模板加量也为1 μg，但同时加5 μl的本节实验步骤2处理后的上清液。(5)PCR扩增、电泳、染色及拍照：同前。本实验重复3次。
二、结果
1.两种不同方法提取DNA时的获取率：酚、氯仿抽提组:5ml村林细胞的DNA的平均获取量为82.4 μg±1.04 μg。Chelex 100组，0.5ml村林细胞的DNA的平均获取量9.10 μg±2.84 μg。经统计学检验，t值为0.899 5，P=0.380 25，两组间的差异无显著性。
2.两种不同DNA提取方法PCR敏感性的比较：用以Chelex 100为介质抽提的DNA进行PCR扩增时，其可检测的最低含量为0.3%，即3ng/1 μg。用酚、氯仿抽提的DNA进行PCR扩增，其可检测的最低含量为0.2%，即2ng/1 μg(1)。
1～6:稀释度分别为0.1％、0.2%、0.3%、0.5%、1%、5%，M：Marker Marker左侧为以Chelex 100为介质抽提组，右侧为酚、氯仿抽提组 1 两种不同方法抽提DNA后梯度稀释、PCR扩增结果
3.两者不同DNA提取方法的PCR准确性的比较：结果显示单链位置无差异，表明以Chelex 100为介质抽提的DNA进行PCR扩增的产物经SSCP及银染后与经酚、氯仿抽提的无差异。
4.血红蛋白的存在对PCR敏感性的影响：实验结果显示，两组PCR扩增产物条带在紫外灯下亮度无差异，表明，用Chelex 100 为介质抽提DNA时，红细胞的存在与否，不影响PCR的敏感性（2）。
1～4:稀释度分别为0.3%、0.5%、1%、5%；M:Marker;Marker左侧为不含血组,右侧为含血组含血与不含血标本PCR扩增结果
三、讨论
在有关分子生物学的研究中，DNA提取的方法很多，但由于操作步骤多易污染，所用的有机溶剂对人体有害，且标本量要求多，保存要求高；或者由于DNA的获取量少，且有PCR扩增的抑制因素的存在，使PCR扩增的结果不稳定［5］，严重影响了该方法在某些方面的应用。
Chelex 100 做为一种离子螯合剂，由苯乙烯和苯二乙烯组成。其悬液在碱性环境(pH 10-11)和100℃的条件下，可导致细胞膜的破裂和DNA的变性并释放出来［5］。本实验通过对两种不同抽提DNA进行PCR扩增的方法的比较，发现以Chelex 100为介质抽提DNA时，DNA的获取率与经典的酚、氯仿抽提法的无差异。这是由于前一方法虽然存在DNA释放得是否完全以及仍有一部分由于高温而降解的问题［8］，但酚、氯仿抽提时由于抽提过程中含有DNA的水相在转移过程中不可避免地要损失一部分，使得DNA的获取率也降低，导致二者在DNA的获取率方面差异无显著性。
此外，本实验结果还表明，用此方法抽提DNA进行PCR扩增的阈值高于经典的酚、氯仿抽提法的：阈值分别为0.3%和0.2%，而忠实性无影响。DNA在［8］100℃的条件下，可发生大量的降解，Sepp等研究证明，沸水浴处理后，所得的DNA的片段在200 bp以下，且量少。这主要是由于标本中的金属离子在高温和低离子强度的条件下对DNA降解的催化作用所致［5］。而在有Chelex 100存在的条件下，金属离子被结合，阻止了其对DNA降解的催化作用，同时，由于Chelex 100 的颗粒在离心后沉淀下来，不会干扰PCR反应体系中的Mg2+浓度，且借助于PCR反应体系中缓冲液，其碱性的上清液也不会影响到PCR的扩增反应。但是，由于高温本身也有一定程度降解DNA的作用，使得该方法提取的DNA片段在1 000 bp以下［8］，其中可含有低于80bp的小片段，也可出现DNA片段断裂在PCR扩增的靶序列区域内。这使得有效的靶序列的拷贝数减少，导致了用以Chelex 100为介质抽提DNA进行扩增的方法的阈值稍高于酚、氯仿抽提法的阈值，而PCR的忠实性无影响。
再者，本实验中，两种不同DNA抽提方法在用梯度稀释进行敏感度检测时的敏感度分别为0.3%(3ng/1 μg)和2%(2ng/1 μg)。由于0.1 μg外周血单个核细胞DNA约含有104个不同的重链基因，上述敏感度分别相当于1 000个外周血有核细胞中可检出3个和2个肿瘤细胞。
另外，在含血的标本中，血红蛋白去除不彻底，其中的卟啉化合物可抑制PCR扩增。在酚、氯仿抽提时，由于蛋白质被去除，也可通过预先去除红细胞，使得卟啉化合物得到去除或明显减少。而在以Chelex 100为介质抽提DNA时，由于未用蛋白酶K消化，卟啉化合物很少从血红蛋白中释放出来，且可能还可以通过与Chelex 100结合，使得PCR扩增不受影响［5］，本实验的结果证实了这一点。
由于此方法获取的DNA的片段小于1 000 bp，故不能用于扩增靶片段大于1 000 bp的PCR实验中，也不适用于Southern杂交中，应引起注意。
作者单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院儿内血液／肿瘤科（步嵘、王耀平）；上海铁道大学医学院附属甘泉医院检验科（叶元康）
参考文献Fey MF, Pilkington SP, Summers C, et al.Molecular diagnosis of hoematological disorders using DNA from stored bone marrow slides.Br J of Hoematol, 1987,67:489-492.2 陈勖奇.从骨髓涂片提取DNA用于PCR扩增.中华内科杂志,1993,32:655-655.3 刘艳平, 张鹏，朱平.PCR方法分析骨髓涂片微量DNA－检测微量残留病.中华血液杂志,1993,14:648-649.4 金冬雁，黎孟枫译.见：Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.主编.分子克隆.第2版.北京：科学出版社.1993.456-494.5 Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R.Chelex 100 as a Medium for simple extraction of DNA for PCR-Based typing from forensic material.Biotechniques 1991,10:506-513.6 Trainor KJ, Brisco MJ, Wan JH, et al.gene rearrangement in B-and T-lymphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction.Blood, 1991,78:192-196.7 Yap EPH, Mcgee JOD.Non-isotopic Single-Strang Conformation Polymorphism.In: Griffin H.G, Griffin AM, eds.PCR Technology.Boca Raton: CRC Pre, 1994.165-177.8 Sepp R, Szabo I, Uda H, et al.Rapid techniques for DNA extraction from routinely proceed archival tiue for use in PCR.J Clin Pathol, 1994,47:318-323.(本文编辑：蔡振国)
(收稿：1998-08-15 修回：1999-07-23)
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