Padlock探针设计由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“设计探针”。
1.4 Padloek探针的设计
从GenBank中下载需要检测细菌的ITS序列,与GenBank登录的100余种细菌序列进行比较。然后选取待检测病原菌核酸序列特异部分作为padlock探针的T2端,序列特异部分临近端作为探针的Tl端。所有探针的杂交温度都采用HyTherTM来预测(http://ozone2:chem.wayne.edu/)。在设计探针时,采用Oligo6软件对所有探针的二级结构进行预测,避免设计的探针出现严重的二级结构从而影响杂交的结果。
每条探针的zipCode序列都是在GeneFlexTM TagArray set(Affymetrix)中选取的,在选的过程中,对每一个ZipCode序列都在NCBI中进行BLAST,以保证其特异性。对于每一条探针上的ZipCode序列,我们都设计一条与其完全互补的核酸序列用于Macroarray高通量检测。1.3 锁式探针
1.3.1 锁式探针的结构
典型的锁式探针的结构如图1.1所示，其两端是与靶序列互补的长度为15-25bp的短片段，中间是一段长度约为50-80 bp的连接序列，具有扩增的引物结合位点以及用于杂交的zipcode序列，有的锁式探针没有zipcode序列。探针与靶序列结合的特异性由两个末端的序列保证。只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中且二者完全互补配对时，线型锁式探针才能在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。用以扩增锁式探针的引物可以是通用引物，从而实现使用一对引物扩增多条锁式探针，也可以是半特异性的引物。半特异性引物是指两条引物中的一条是通用的，而另外一条具有模板特异性，其5’端带有一个特殊的标记有荧光发光基团和荧光淬灭基团的发夹结构，主要用于检测单核苷酸多态性或检测两种不同的核酸（或核酸片段）。Zipcode序列是一段与模板序列（或检测核酸）无同源性的序列，根据模板不同而变化，主要用于锁式探针扩增产物的杂交。Zipcode序列或C-zipcode序列固定在固相支持物后可以与锁式探针扩增产物进行反向斑点杂交，通过显色检测或荧光扫描，读出特定杂交信号，判断待检测的模板是否存在，从而实现高通量检测。锁式探针这种独特的设计，满足了专化性检测需要，而且具有多种扩增方式以及可以携带检测标记物，可以适应多种检测平台。超分支滚环扩增
上游引物结合到 C-probe 上并被 DNA 聚合酶延伸，生成一条长的单链，具有多条下游引物的多个结合位点。每条下游引物都被延伸并替换后面的引物及这些引物的延伸产物。下游引物延伸得到的产物上又具有上游引物的结合位点，从而进一步得到延伸和扩增，因而生成大量的级联扩增产物。
基于锁式探针的滚环扩增技术在植物病原检测中的应用
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