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西安交通大学 机械学院
实验室实习报告
陈萱 2130101001
一、依托单位：
单位名称：先进制造技术研究所 研究方向：生物三维打印 责任教师：连芩 指导硕士生：毛伟
时间及地点：七月三日至七月十四日；生物制造实验室
二、认知内容和方式：
1、了解所在研究室或课题组的研究方向、科研项目及特色成果。
2、观摩或适当参与科研工作，协助研究生完成有关仪器操作、数据记录或处理等方面的工作，了解科学研究基本方法、基本过程。
三、实验相关
实验名称：无菌操作及细胞培养 实验过程：
实验器具准备
（1）蓝盖瓶：
洗洁精清洗，自来水冲洗干净，放入烘箱烘干后在酸缸中浸泡，戴耐酸手套，捞出蓝盖瓶，自来水冲洗后用纯净水冲洗，放入烘箱烘干
盖上瓶盖，用锡箔纸包裹瓶盖，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后拿出放入烘箱烘干，烘干后放入紫外灯储物柜中备用。（2）移液器
一个完整的移液循环：枪头安装，容量设定，预洗吸头，吸液，放液，卸去吸头
枪头：10μ L，100μ L，1000μ L，均为一次性用品，使用后丢掉。5ml 和10ml 枪头为循环使用，用过的丢入超声清洗机中。
装配移液枪头：将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧
预洗枪头：为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。高温和低温不适合润洗。浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在白套筒室内形成负压，从而产生漏液，需要预洗四到六次，让白套筒室内的气体达到饱和，负压就会自动消失（3）超净台
使用前准备：根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。操作野消毒：超净工作台台面每次实验前要用 75％酒精擦洗。然后紫外线照射 30min。在工作台面消毒时不能将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不能过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。
洗手和着装：带手套，并于开始操作前要用 75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩。
火焰消毒：首先要点燃酒精灯。酒精灯内添加的是无水乙醇，不可过满或者过少，添加至 2/3 为宜。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。操作：进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。
实验材料准备：
1、将alginate粉末紫外光下照射12h
2、用去离子水配制3.5%alginate
3、配置4%CaCl2 通过过滤网灭菌
4、预热培养液、PBS 液和胰蛋白酶
5、培养箱内取出细胞
图1：高分子溶液搅拌
细胞传代培养过程：
传代前准备： 1）.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃水浴锅内预热。2）.点燃酒精灯；准备好将要使用的无菌培养皿或者培养瓶；取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
3）.从培养箱内取出细胞：不可倒置培养皿，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
4）.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。胰蛋白酶消化；
1）.加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS冲洗，加入适量胰蛋白酶液，消化液的量以盖住细胞最好。
2）.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3）.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。吹打分散细胞：
1）.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2）.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10ml 离心管中。
3）.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000 转/分钟离心 3-5 分钟。4）.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
图2：吹打分散细胞 分装稀释细胞：
1）.分装：将细胞悬液吸出分装至 2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
图3、4、5：分装好的细胞
2）.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5×105/ml。最后要做好标记。细胞计数：66 细胞浓度（细胞数/ml）=4 个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数=16.5×104 继续培养：
图6：细胞在培养皿中贴壁生长 图7：细胞在海藻酸钠中封装
细胞冻存实验过程：
（1）冻存前一天换液，取细胞形态好和无污染培养瓶换液。
（2）冻存盒中液体为异丙醇，每冻存 5 次后更换一次。4℃预冷。
（3）混合消化液消化细胞，终止消化后离心 1000 r/min，5 分钟，弃上清，加入 4℃4预冷的冷冻保存液重悬，调整细胞浓度为（1-2）×106-107/ml。
（5）将细胞悬液分装至 2ml 冻存管中，每管 1～1.5 ml；将冻存管口封，贴上标签（6）放入 4 度预冷的程序性降温盒中，-80 度冰箱过夜后取出放入液氮罐中。慢冻快融。
细胞的复苏实验过程(由于设备故障未进行，以下为理论了解)：
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196 ℃液氮中的细胞快速融化至 37 ℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。实验前准备：
1）.将水浴锅预热至 37 ℃，培养液预热 37 ℃后吸出 5 ml 放入无菌离心管中。2）.用 75％酒精擦拭超净台，并紫外线照射 30 min。
3）.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。取出冻存管：
1）.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2）.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。迅速解冻：
1）.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2）.约 1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。吸取细胞悬液加入准备好的 37℃培养液中。平衡离心：
用架盘天平平衡后，放入离心机中 1000 r/min 离心 3 min。制备细胞悬液： 1）.吸弃上清液。
2）.向离心管内加入 10 ml 培养液，吹打制成细胞悬液。细胞计数：
细胞计数和活力检测：取待测细胞悬液 0.1 ml和 0.4%台盼蓝 0.1 ml，混匀，静置 2～3 min。
从计数板边缘轻轻加10 μL 染色的细胞悬液，使之充满在计数板与盖玻片间的空隙；于显微低倍镜下计 4 角 4 个大方格内的活细胞（透明未着色）和死亡细胞（细胞核着蓝色）的总数，然后用下式计算：
细胞浓度（细胞数/ml）=4 个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数 细胞活力=活细胞数/（活细胞数+死亡细胞数）×100％
计数时，对大方格边缘压线细胞应计上不计下，计左不计右。七.培养细胞
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 37 ℃和 5％CO2的培养
箱内 2-4 小时（或者 24-48 小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误：水浴锅未预热或者未预热到 37 ℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
实习感受
这次实习让我了解研究室的一些相关实验，对部分的仪器操作有了基本的认识，也扩宽了我的视野。在以往的认知里我认为机械工程专业的涉及范围只有齿轮、机床、机械等传统研究，然而对先进所得实习过程让我知道机械行业还可以涉及到跨专业的生物打印技术。
我认为生物打印技术是非常有发展前景的一项前沿技术，试想未来某一天从培养单细胞起，进行培养，然后我们将用3D打印机将这些细胞组合在一起，形成具有特定功能的具有生物活性的组织，进而这些组织组合打印出一个完整的心脏。无数的心脏病患者就可以得以救治。
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