pcr岗位职责（精选8篇）由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“pcr实验室岗位职责”。
第1篇：PCR销售经理岗位职责[推荐]
1.负责PCR诊断产品的销售，独立或在经销商配合下完成所承担的销售任务。2.配合PCR大区经理建立、健全分销渠道。3.实施执行该区域营销及客户开发计划。4.配合大区经理调査及分析市场。第2篇：PCR实验室
简介
Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据
条件
1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍
2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;
4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行
5、必须在无菌无尘环境下进行操作
功能
能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。
建立方法
1、建立样品准备区
这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、建立前PCR区。
该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作。
⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物。
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法。
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。
7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动
第3篇：检验PCR
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 耗材质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-006
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 1页，共 4 页
耗材质检的标准操作程序 1.目的：保证每批用于临床基因扩增检验实验室的耗材质量能符合临床基因扩增检验实验室检验要求，保证新批次的耗材不对检验结果产生偏差。
2.适用范围：各种用于临床基因扩增检验实验室的离心管和吸头 3.操作人: 陈宇明
季秀玲 4.程序细则
所有验收标准均根据本实验室检验标本的要求制定，所制定的验收方法仅适用于本实验室耗材的验收。
4.1 离心管的验收 4.1.1 目测:检查离心管有无畸形、破损、盖子无法关闭。4.1.2 实验检测：每批随机抽样10个离心管用于实验检测。4.1.3 加半量生理盐水后，10000rpm 20min，如发现有管盖爆开或漏液情况发生，即认为该批离心管不符合本临床基因扩增检验实验室实验要求，作退货处理。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 可移动紫外消毒车使用的 标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-016
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 3 页
4.1 当紫外灯管损坏时须更换紫外灯管，保证消毒的效果。4.2 消毒后应记录在临床基因扩增检验实验室日记录表中
记录
1.临床基因扩增检验实验室日记录表（样张）.复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 可移动紫外消毒车使用的 标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-016
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 3 页，共 3 页
培训记录
签名 日期 签名 日期 签名 日期
年度审核记录
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 1 页，共 13 页
室内质量控制的标准操作程序
1.目的：随时了解并控制临床基因扩增检验实验室检测的精密度变化。2.适用范围：各种临床基因扩增检验项目检测全过程 3.相关职任人: 王洁 陈宇明 季秀玲 4.程序细则
4.1临床基因扩增检验实验室的室内质量控制指整个基因扩增检验的所有阶段，包括测定分析前的标本采集处理，测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告各步骤的质量控制。
4.2质控物：1个试剂空白、1个阴性和2个水平的阳性质控与待测临床标本同等处理提取核酸及扩增检测，实验结束后将质控数据记录在临床基因扩增检验实验室日记录表中。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 13 页
4.3阴性质控：仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管。
4.4阳性质控：HBV-DNA用已知的阳性质控品或HCV-RNA用临床阳性标本来监测核酸提取及扩增效率；用已提取纯化的靶DNA或cDNA来监测基因扩增的有效性。4.5实验有效性判断：临床基因扩增检验实验室负责人核对阴性、阳性质控品的检测结果值，若与预期结果相符，可判定待测标本测定结果有效，一旦质控中有出现任何检测结果与预期值不相符，均应判定实验无效。具体参见实验结果有效性判断的标准操作程序。
4.6定量结果判定：临床基因扩增检验实验室检测操作的工作人员用已知拷贝数的阳性标准品浓度梯度系列同步扩增检测，建立标准曲线（拟合度应≥0.970）,然后根据标准曲线推算出待测样本的拷贝数。
4.7临床基因扩增检验实验室负责人使用Westgard多规则控制程序作为质控判断规则。
老婆我爱你 2009-8-17 16:14:08
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 9 页，共 13 页
4.10.3分析时发现大批甚至所有的标本都扩增了（结果均有数值出现），判断为失控。4.10.4 分析发现阳性对照没有扩增或者结果
4.10.5分析时发现所有标准曲线CT值与平时均至少相差+/-3或以上时，判断为失控。4.10.6分析时发现标准品曲线数少于4个时，应判断为失控。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 10 页，共 13 页
4.11室内质评的持续性改进程序
4.11.1 每半年分别统计HBV-DNA和HCV-RNA在1年内（数据跨度多于1年的统计1年中的数据）的所有斜率、截距、回归率和每次用来构建标准曲线的标准品浓度梯度数量。求出均值和SD；分别统计临床基因扩增检验实验室每个操作的工作人员各个项目各个批号高低值质控品的CV值，分别求出各人所有高值质控品和低值质控品的CV值均数和SD。4.11.2
观察斜率、截距的均值±2SD所求出的值是否在所规定的范 围之内，观察回归率。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 11 页，共 13 页
4.11.3 实施整改3个月后统计此3个月数据，对整改措施做出评估，写出对整改措施的评估报告，分析整改措施对检验质量改善、无效或者导致检验质量下降的原因。若统计数据表明措施无效或措施使实验质量变得更糟糕则去除该措施，根据分析的原因重新制定整改措施；若数据表明整改措施导致检验质量改善，应将整改措施中的内容在修改质量手册时写入。4.11.4所有书面整改措施报告、对整改措施的评估报告、统计资料存档保存至少2年。4.11.5 每季度统计HBV-DNA、HCV-RNA标本检测的阳性率、复做率、阴性率，以监测实验的质量。所有记录保存至少2年。
老婆我爱你 2009-8-17 16:14:47 复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 12 页，共 13 页
参考文献
1.乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒使用说明书.2.冯仁丰.统计质量控制.冯仁丰主编.临床检验质量管理技术基础.上海：上海科技技术文献出版社，2003：151-241.3.吴星，王佑春，张华远等.乙型肝炎病毒DNA国家定量标准品的研制及初步应用.中华肝脏病杂志.2003，11（7）：402-404.相关文件
1.临床基因扩增检验实验室实验结果有效性判断的标准操作程序.《临床基因扩增检验实验室标准操作程序（第一版）》.2005：120-123.记录
1.华山医院2005年1～4月临床基因扩增检验实验室HBV和HCV截距统计表.2.临床基因扩增检验实验室日记录表（样张）.3.室内质控失控记录表（样张）.复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室内质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-017
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 13 页，共 13 页
培训记录
签名 日期 签名 日期 签名 日期
年度审核记录
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
签名
日期
****年**月**日
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室间质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-018
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 1 页，共 6 页
室间质量控制的标准操作程序
1.目的：室间质评（EQA）是临床基因扩增检验实验室质量控制体系中重要部分，是保证患者检验结果和其报告的准确性和可靠性，以及各临床基因扩增检验实验室间结果的可比性的重要手段。
2.适用范围：临床基因扩增检验室 3.相关职任人: 王洁 季秀玲 陈宇明 4.程序细则
4.1
室间质控标本的处理、检测和结果上报 4.1.1 质控标本的接收和验收：收到质控血清后由临床基因扩增检验实验室负责人登记、签字，根据质控标本的有关说明对血清的数量、批号、包装进行验收并将质控标本按要求置-20℃保存于样本准备室。4.1.2 室间质控若需要复溶的，检测前先根据说明对质控物进行复溶。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 室间质量控制的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-018
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 6 页
4.1.3 质控样本必须按临床基因扩增检验实验室常规工作进行，由进行常规工作的人员检测，工作人员必须使用临床基因扩增检验实验室的常规检测方法和试剂，不得特殊对待。检测结果须在截止日期前上报。4.1.4 严禁与其它临床基因扩增检验实验室交流室间质评的检测结果。4.2 室间质控的持续性改进程序：分析前（降低样本拒收率）、分析中（缩短TAT）、分析中（减少报告补发率）。
4.2.1质控的检测结果和反馈结果均记录于室间质控记录表，临床基因扩增检验实验室负责人根据反馈结果分析室间质控的状态，如有出控（无法接受的结果）应查找原因，采取相应的措施，并写出书面整改报告。4.2.2 检查收到标本后存放至报告发出的冰箱温度记录，观察是否有温度过高的记录，若有则可能是冰箱温度失控导致DNA或RNA的降解；若没有冰箱温度失控问题，应排除标本收集保存方面的问题。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 耗材质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-006
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 4 页
4.2 吸头的验收 4.2.1 目测：检查吸头有无畸形、破损。4.2.2 实验检测:每批随机抽样10个吸头用于实验检测。4.2.3 套上适合的吸头吸取适量液体，观察加样器的吸孔，在排除堵塞、漏气等加样器因素后，如有异常发现，即认为该批吸头不符合本临床基因扩增检验实验室要求，作退货处理。4.3 抑制物试验 4.3.1 所有新购买的耗材必须经过抑制物试验，证明与前批次耗材没有抑制物差别方可正式启用，经上述检测发现有不合格情况，作退货处理。4.3.2 参与抑制物试验的离心管必须经（121±2）℃15min高压消毒灭菌并烘干，带滤芯的吸头应该直接参与抑制物试验。4.4 按照试剂质检的标准操作程序，同时用老批号的耗材和新批号的耗材处理后，同时上机扩增，若发现使用新批号耗材的结果与用老批号耗材的结果无系统性降低则说明新批号耗材通过抑制物试验。将实验结果记录在耗材验收记录表中。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 耗材质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-006
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 3 页，共 4 页
参考文献
1.乙型肝炎(HBV)荧光定量PCR检测的标准操作程序.《临床基因扩增检验实验室标准操作程序（第一版）》.2005:97-102.2.禽流感病毒通用荧光RT-PCR 检测方法.中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.1-2004 相关文件
1.试剂质检的标准操作程序《临床基因扩增检验实验室标准操作程序.（第一版）》.2005:17-21.记录
1.耗材验收记录表（样张）.老婆我爱你 2009-08-14 15:09:04 复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 试剂质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-007
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 1页，共 5 页
试剂质检的标准操作程序
1.目的：保证每批用于临床基因扩增检验实验室的试剂质量良好，符合要求。
2.适用范围：各种用于临床基因扩增检验实验室的核酸扩增荧光检测试剂（HBV、HCV）3.操作人：季秀玲、陈宇明 4.程序细则
4.1 收到试剂后，目测试剂是否处于冻存状态。
4.2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、检测项目、批准文号、批号和有效期等）和内包装（试剂瓶完整性、真空包装完整性、使用说明书有否等）。4.3 及时将试剂转入试剂准备室的－20℃冰箱保存。将标准品和阴阳性质控品保存在样本准备室的－20℃冰箱保存。
4.4 最迟在前批次试剂存量可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验1。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 试剂质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-007
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 5 页
4.5 效验实验1：在使用前批次试剂进行常规实验的同时带上少量新批次的试剂。用新批次试剂空白、阴性质控、低值阳性质控品、高值阳性质控以及2个随机选中的标本，若阴阳性质控结果均与前批试剂差别不大，2个标本的结果与前次结果均相符，可通过验收。若试剂空白、阴性质控出现阳性结果、低值阳性质控品出现阴性结果或结果偏差太大等情况时要求对新批号试剂进行效验实验2。4.6 效验实验2： 4.6.1 要求设置：试剂对照、阴性质控、低值阳性质控品、高值阳性质控各一管，阳性标准品梯度（103、104、105、106、107）。4.6.2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT值大于27，需重复实验确证试剂污染。b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 试剂质检的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-007
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 3 页，共 5 页
4.6.3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。空白对照没有扩增，阴性质控出现扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。4.6.4 阳性对照检出，阳性标准品未被检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大3个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。4.6.5 阴性质控没有扩增，阳性对照正常检出，相关性（－0.97～－1之间）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。4.7 将实验结果记录在试剂验收记录表中。
老婆我爱你 2009-08-14 15:10:10
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 仪器设备管理的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-008
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 1 页，共 4 页
仪器设备管理的标准操作程序
1.目的：保证临床基因扩增检验实验室的仪器设备得到妥善的管理，保障工作正常进行。2.范围：临床基因扩增检验实验室的所有仪器设备
3.职责：仪器设备的管理、维护、保养等的具体事项由临床基因扩增检验实验室负责人负责管理。
4.程序细则
4.1 临床基因扩增检验实验室各实验室的仪器设备各实验室专用。
4.2 建档管理：需要建档管理的临床基因扩增检验实验室仪器设备应包括ABI PRISM 7000型荧光定量PCR仪、微量加样器、高速台式冷冻离心机、生物安全柜。4.2.1 建档的临床基因扩增检验实验室仪器设备的一般情况应包括：名称、制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识、接受日期和启用日期、目前放置地点，接受时状态等。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 仪器设备管理的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-008
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 2 页，共 4 页
4.2.2 建档的临床基因扩增检验实验室仪器设备的相关文件包括：仪器设备的说明书，操作手册，保修卡等，有关文件（或复印件）的文件序号，名称，校准和/或检定的日期和结果以及下次校准和/或检定的日期、迄今所进行的维护和今后维护计划的细节、管理负责人等。4.2.3 临床基因扩增检验实验室仪器设备的损坏、故障、修理须作如下记录：日期、仪器名称、故障现象、检查情况、处理意见、处理结果、维修人员签名等。4.2.4 有问题的临床基因扩增检验实验室仪器设备加贴明显的黄色停用标识，标识上应有停用日期及原因；可搬动的仪器移至装备科报修，不可移动的设备应该盖上布，封存待修。4.2.5 修好的临床基因扩增检验实验室仪器设备重新经校准、检定或检测合格方能再次投入使用。
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 仪器设备管理的标准操作程序 版 本 号：1.0
文件编号：HS-JY-CZ-PCR-008
生效日期：2005年03月01日
页
码： 第 3 页，共 4 页
4.2.6 临床基因扩增检验实验室仪器设备的报废处理：因使用寿命、损坏、故障导致仪器设备不能满足检测需要时，该设备可报废。由临床基因扩增检验实验室负责人填写报废申请，检验医学中心主任核实，装备科批准后由许小凤在设备档案中签名注销。
4.2.7 临床基因扩增检验实验室的仪器设备按照规定需要进行校准和检定的有：温度计、温度湿度计、微量加样器、ABI PRISM 7000型荧光定量PCR仪。校准报告至少留档保存2年。参考文献
1.申子瑜，李金明等.临床基因扩增检验实验室技术验收表.申子瑜，李金明主编.临床基因扩增检验技术.北京：人民卫生出版社，2002： 196-201.
第4篇：PCR检验
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
荧光定量PCR技术检测的报告形式 一，拷贝数的意义：
表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量
二，拷贝数与病原体的关系：
拷贝数与病原体的数量成正相关
三，报告形式：1如果标本量是可以定量的，如血液等，则检测结果报告为：IU/ml(可溯源到国际标准物质的标准品)如HBV-DNA：检测下限：100IU/毫升 即：
Ct值得意义
扩增越靠后定量的重复性就越差
--扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响，偏离线性--在Ct值处重复性非常好--荧光定量技术要求在低浓度进行
荧光定量PCR在临床中的应用 一,感染性疾病 1，肝炎病毒定量检测
2，结核杆菌及呼吸道病原体检测 3，优生优育（TORCH）相关项目检测 4，性病病原体检测
5，手足口病相关病毒EV71，柯萨奇病毒的检测 二，肿瘤个体化诊断与治疗 三，遗传性疾病 四，疾病风险评估
乙型肝炎病毒（Hepatitis B）
HBV基因分型与CHB（临床遗传性疾病）的关系 全基因组测序HBV可分为A.B.C.D.E.F.G.H 8个基因型 HBV基因型--HBV基因型与病毒复制及病毒标志物表达的关系--HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系
血清学指标（-）不能排除HBV感染 HBeAg(-)/HBV-DNA(+)编码e抗原的pre C区基因极易出现变异，在pre C区出现终止密码子，在pre C区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原。导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。
HBV基因型---HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--HBV基因型是影响慢性乙型肝炎的临床转归的主要决定因素之一。
--HBV感染的临床转归一方面决定于患者的年龄和免疫能力，另一方面与基因型种类密切相关。在B,C为优势地区，C型具有较强的疾病能力，预后差；在以A,D为优势的地区，D型具有较强的致病性，肝病严重，预后不良；基因型C在乙肝后肝硬化的发病中起一定的作用，然而基因型B与年轻无肝硬化患者肝癌的发生有关。
HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系
--干扰素抗病毒疗效与HBV基因型有一定的相关性，基因C和D对干扰素的治疗反应比基因型A和B要差
（HBV基因型与病毒复制与清除。病毒变异.临床表现.治疗应答和预后均有关系，提示不同基因型具有不的致病性）
HBV DNA与疾病的诊断 HBV DNA与乙肝”两对半“
---”两对半”：机体的免疫反应状态，为间接指标----HBV DNA是乙肝病毒的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠，最直接的指标。
----“携带者”，“大三阳”，“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。
“大三阳”与HBV-DNA：
“ HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）”提示患者体内HBV-DNA呈活动性复制，传染性强，荧光定量PCR方法检测HBV-DNA阳性检出率大于80-90%，且病毒载量>10的六次方IU/ml “小三阳”与HBV-DNA：
“ HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）”，HBV-DNA阳性率为40-80%左右，且病毒载量
HBeAb（+）表明HBV复制处于较低水平并可能和宿主DNA发生整合，导致含量较低，应进行HBV-DNA定量检测。
常规结核病实验室诊断方法及不足--细胞培养“金标准”,周期长
--痰涂片作抗酸染色：灵敏度差，检出率《30%。特异性差，无法将结核杆菌和其他分枝杆菌区分开--血清学诊断：交叉反应，假阳性
FQ-PCR诊断结核的关键点
--痰液，肺及支气管灌洗液--肺结核--血液-播散性结核和各脏器的结核病--脑脊液-中枢神经系统结核病
--宫颈拭子，尿道拭子-泌尿生殖系统结核病--胸水-结核性胸膜炎--腹水-结核性腹膜炎
HCV的基因型/亚型 {6个型，68个亚型}-1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m-2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m-3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,-4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t-5a-6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n 中国亚型1b（66%），2a（14%），对抗病毒治疗应答不同，因此治疗方案不同。HCV的基因耐药突变
特异基因靶向治疗（小分子抑制物）中靶点编码区的耐药--HCV蛋白酶（NS3-4A）--RNV酶（NS5b）HCV的基因型与药物治疗--现知欧美国家多数HCV-1型感染，而亚洲国家以2型为主，三型次之
--三型感染临床症状较重，有引起严重肝病的倾向--1b型感染对干扰素治疗不敏感，效果差，2a型感染用干扰素治疗效果好。
HCV RNA 定量的临床意义？？？？
TORCH感染特点
--母婴传播的主要病原体
--引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因--自然状态下呈隐性感染
--怀孕，多次输血，AIDS等易发生显性感染--可致多发性，全身性感染
--只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防 TORCH相关病原体检测-弓形虫（TOX）-风疹病毒（RV）-人巨细胞病毒（HCMV）-单纯疱疹病毒（HSV-2）
基因检测与预测医学
基因检测使预测医学称为可能。疾病分险基因，易感基因的检测，不同人群差异基因的检测，可以全面评估个体对相关疾病的患病风险，从而预测疾病的发生，早期干预，预防。
结核杆菌与呼吸道病原体检测--结核杆菌（TB）--EB病毒（EBV）--肺炎衣原体（CP）--肺炎支原体（MP）常见性传播病原体检测-淋球菌（NGH）-沙眼衣原体（CT）-解脲支原体（UU）-梅毒螺旋体（TP）-单纯疱疹病毒（HSV）-乳头瘤病毒（HPV）-人类免疫缺陷病毒（HIV）
第5篇：PCR实验室
高端PCR实验室控制设计说明
PCR实验室即分子生物学实验室，在医疗、科研、生物技术方面得到广泛的应用。因其在不同行业的应用各有区别，在具体设计时也有不同之处，就医疗机构的应用而言，主要使用三区或四区设计，即试剂准备区、样品提取区、扩增分析区；此类三区设计时候应用于类似荧光定量型或同类PCR分析设备，及扩增与分析过程在设备内一次完成。而四区设计在三区的基础上讲扩增分析区拆分为扩增区与分析区适用于其他类型的pcr设备及手工处理。
在PCR实验的设计上，经过多年的经验累积，已经在一些关键技术上达成了共识。因为PCR实验中所产生的DNA与RNA片段过于微小，以至于可以穿透高效过滤器，所以在实验室设计上已经不在强制要求设计高效净化系统，但是为了提高实验环境水平及保护实验室内的敖贵设备方面，如果在具备条件的情况下可考虑追加高效空气净化系统；建议净化级别万级。在PCR实验中所产生的DNA与RNA片段污染是一直以来PCR实验的重点问题。此类污染主要至上次试验中所产生的基因片段对下次试验产生的污染，而且一旦试验环境中的污染形成后很难处理。因为消毒等传统方式对于基因污染没有很良好的效果。所以在PCR实验室设计中一般将整套实验室设计为全新风型实验室，这样而已通过有效的换气次数来达到净化室内污染的作用。而在控制方面也有很多不同之处，因为各单位对PCR实验的重视程度各有不同，所以在设计上也有不同，主要的控制设计有定送定排式压力控制系统、变送定排式压力控制系统变送变排式压力控制系统。在控制设备方面也有很多区分如压力无关型控制系统、压力有关型控制系统。
根据业主要求，本PCR实验室为三区设计，各区可独立使用，不设置高效过滤系统等相关要求，根据业主以上要求，我方给出的设计方案为压力无关型变送变排压力控制系统。本系统的特点是，设备启动后可根据实验室内使用节点调节送风量及排风量来控制各房间状态，系统说明见下图
每个房间可分别控制，使用时通过房间开关输出启动信号，当设备接到启动信号时设备运行，运行中根据管道压力反馈决定变频器大小，房间内送排风量由压力无关型风量调节阀控制。 当有多个房间开启或关闭时，设备更加管道压力反馈，调节设备变频器增加或减少送排风量来稳定管道压力。各房间内压力又房间内的压力无关型定风量阀进行控制。
当BSC（生物安全柜，B2全排）开启时BSC专用供风机组运行，BSC-供风机-排风机连锁运转。
当BSC做变风量调节时，根据房间内压力变化，BSC专用供风机组前安装的压力无关型变风量调节阀根据压力变化增减送风量，确保房间压力执行在可控范围内。
当房间不适用时，房间与缓冲间均关闭电动密闭阀，确保房间处在密闭状态避免布朗运动造成的可能污染风险。
房间换气次数均按照一定净化标准设计，当室内污染发生时，通过一定时间的换气处理后，污染问题可以基本解决。 本系统如果业主需要，可在室内送风口末端加装高效过滤设备，房间可升级为净化型实验室。
压力无关型风阀简介：压力无关型风阀的特点是不会根据管道压力的变化而影响风阀内部的送风量，在一定管道压力区间内能够自行调节阀体阻力，来稳定送风量，是高端实验室必备的关键部件，目前此类阀体技术均有国外生产厂家控制，目前国内主用使用的产品有妥思、文丘里、西门子等品牌。
第6篇：PCR学习心得
参加《临床基因扩增实验室技术人员上岗培训
班》心得
本人于2015年3月10至15日参加了广东省临检中心举办的临床基因扩增实验室技术人员上岗培训班。通过学习，除了取得广东省临检中心颁发的培训证书外，还极大的提高了理论和实验操作水平，现总结如下。
此次培训包括理论培训和实验操作。在理论培训课程当中，卫生部临床检验中心的李金明教授为我们详细讲解了《临床基因扩增实验室设计及质量管理体系的建立》、《临床基因扩增检验的质量保证》等内容。通过学习，了解到临床PCR实验室设计必须遵循各区独立、注意风向、因地制宜，方便工作的原则。质量管理的内涵：写你所做的，做你所写的，记录你已做的，分析你已做的。认识到临床标本的正确采集、运送、保存的重要性，是临床检验的质量保证的关键性环节，是解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一。同时通过病例分析，对于临床基因扩增检验的检验前，检验中，检验后的质量控制，还有实验的结果处理和分析有了重新认识。对于实验室是否出现污染的鉴别，以及出现污染的处理措施有了深刻了解。
临床实验医学的发展现在经历了三个时代，分别是生化诊断时代，免疫诊断时代，和和现在的分子（基因）诊断时代，而现今时代的标志性技术正是PCR技术，是反映疾病本质的实验。正是有临床基因扩增检验技术在癌症等疾病的诊断方面有了多方应用，通过驱动基因的选择，为靶向治疗患者延长了生存期。为个体化诊疗中对疾病的鉴别诊断，诊治方案的设定提供重要的参考依据，同时也为治疗过程中临床对于治疗方案的调整提供依据。临床基因扩增检验技术在个体化诊疗中是不可或缺的一部分，是其重要的组成部分，具有强大的发展潜力和前景。
实验操作内容为EGFR突变基因检测。实验操作过程中，通过认真学习和细致听讲带教老师的规范实验操作，了解到了实验的关键操作，纠正了平常在临床实际工作操作上的一些不良习惯，为日后规范检验操作提供了基础。通过分组亲自操做实验，分析和判断自己的实验结果，做实验记录笔记，基本掌握EGFR突变基因检测。
通过为期六天的理论和实验培训，从中学习到了很多知识，掌握了严格的防污染以及污染的处理措施，了解到实验室设置的人流、物流、气流的走向设计原则，解决了日常工作中的实际问题，为日后临床基因扩增检验工作的开展打下了坚实的基础。了解到临床基因扩增检验技术的发展方向，受益匪浅。
第7篇：PCR经验总结
PCR经验总结
实验注意事项：
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
（2）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。
（3）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（4）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（5）最后加模板DNA，马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（6）实验设阳性、阴性对照。
还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失灵；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂。
问题及解决方案汇总：
一、假阴性，扩增无条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR来减轻或消除。
三、出现非特异扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
五、出现大量引物二聚体
1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；
3.模板浓度过小，适当加大模板量；
4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
8.增加循环数；
9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；
六、高GC与复杂结构的模板处理
将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上，然后置于冰上瞬时冷却，可大大降低二级结构对PCR的影响。
七、长片段与短片段拼接失败（定点突变）
在做定点突变时，倘若突变位点距离基因的某一侧较近（短片段300bp），然后再做基因拼接。确认大小无误后，再以此产物为模板，用基因首尾引物PCR即可。
八、Long PCR无条带
对于>5Kb片段扩增，常规PCR很难得到较好的条带，建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer调整体系；③设计多对引物分段扩增。
PCR增强剂（PCR Enhancer）：
常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，甜菜碱，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。
1.DMSO：解除模板DNA局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是对酶活有抑制作用，且当其浓度大于10％时还会降低保真性。
2.甘油：可降低模板溶解温度（Tm），提高产量，但是对酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促进某些“引物－模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。4.硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。5.甜菜碱：有利于DNA双链的解开，Polymerase的结合，提高PCR的效率。
第8篇：pcr检测技术
《食品安全学》综述
PCR快速检测技术综述
1．前言
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。
2.研究的目的与意义
聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。3.国内外研究现状
3.1.基础研究方面的应用
目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：
[1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因；
[3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变；
3.2.PCR在临床上的应用[2]
[1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。
[2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。[3]在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3．3.在法医学中的应用[3]
例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将4.相关检测技术 4.1.技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温下也能发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。4.2.工作原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 4.3.工作步骤
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度 5.研究方案
医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。5.1研究方法
① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。
② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。
③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，5.2.技术路线
PCR技术
聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。5.3.所用仪器与材料
引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40-60%,浓度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。
4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。
6．研究内容
PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。6．1.检测对象
常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。[4]乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能 6．2检测内容
PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。
PCR技术类型[5]
免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术
复合PCR技术
彩色PCR技术
抗原捕获PCR技术 增敏PCR技术
酶标PCR技术
二温式PCR技术
锚定PCR技术
定量PCR技术
毛细管PCR技术
多重PCR技术
巢式或套式PCR技术 7.预期目标PCR 技术在大肠杆菌O157: H7检测中
（1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物： 正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’
其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld。
徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。
PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。
PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7。
4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中
传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。
参考文献
[1] 葛忠源;荧光定量PCR检测DPV弱毒免疫鸭消化道和呼吸道大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌及其数量变化规律的研究[D];四川农业大学;2006年
[2] 徐焕宾,贲昆龙,曾涛,李劲光;检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用[J];中国病毒学;2001年02期
[3] 顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志[J]，1999，3:31-35 [5] 石岚;实时定量PCR检测IgH基因重排的研究[D];昆明医学院;2004年 [6] 王颖.食品安全学技能训练.2010.10
1.负责PCR诊断产品的销售，独立或在经销商配合下完成所承担的销售任务。2.配合PCR大区经理建立、健全分销渠道。3.实施执行该区域营销及客户开发计划。4.配合大区经理调査及分......
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史......
刀豆文库小编为你整合推荐6篇PCR自我鉴定，也许这些就是您需要的文章，但愿刀豆文库能带给您一些学习、工作上的帮助。......
复旦大学附属华山医院 检验医学中心 上海市乌鲁木齐中路12号 200040 耗材质检的标准操作程序 版 本 号：1.0文件编号：HS-JY-CZ- PCR-006生效日期：2005年03月01日页码： 第 1页，共 4......
简介Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通......
