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《园艺植物生物技术》实验教案
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？
实验二 植物组织培养
一、实验目的植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。
二、实验原理
基于1902年德国科学家哈勃兰特（Haberlandt）提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。
三、主要仪器及试材
仪器：pH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等
试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂
四、实验方法与步骤
（一）培养基母液的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：
1、大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。
KNO
395 g NH4NO3
82.5 g KH2PO
48.5 g MgSO4•7H2O
18.5 g CaCl2•2H2O
22.0 g 注意事项：
（1）配置母液前要仔细清洗存储容器
（2）应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；（3）溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；
（4）夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；
（5）沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的浑浊型沉淀，所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。
2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：
KI
0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O
0.86 g NaMoO4*2H2O
0.025 g CuSO4*5H2O
0.0025 g CoCl2*6H2O
0.0025 g
MnSO4*4H2O
2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。
3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：
甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L4、铁盐的配制（100倍液）：
称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。
5、维生素B的配制（100倍液）：
VB组分 VB1(盐酸硫氨素)VB6(盐酸吡哆素)VB5(烟
酸)
改良MT 1g 1g 0.5g
MS 10 mg 50 mg 50 mg 分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1L。
注: 需要溶解完一个再加另一个；VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。
6、Vc的配制（100倍液）：
称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1L即可。
7、其它溶液配制：
BA，NAA，IBA，GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH彻底溶解，再加水定容。配好后室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。
注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在制作培养基时使用。这样不容易产生沉淀。
（二）培养基配制
母液配好后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1L,调节pH至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。
大量元素(10倍液)
ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)ml 铁盐（100倍）ml 维生素B（100倍）ml Vc（100倍）ml 蔗糖g 琼脂
7.5 g
（三）接种与培养
在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。
五、实验注意事项
1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。
2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。
六、实验结果处理
一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。
七、思考题
影响植物组织培养的因素有哪些？
主要参考文献
1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立。植物学通报,2005，22:37-42。
2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验三 植物DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的DNA 提取是开展分子生物学的重要前提之一，高质量的DNA直接关系到分子标记、基因克隆、图谱构建及功能基因组研究等工作的成败。通过本实验应了解常用DNA提取方法的原理和技术，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA检测技术，为将来从事园艺植物生物技术研究奠定基础。
二、实验原理
植物的遗传物质是DNA，植物细胞内含有丰富的遗传物质。在机械研磨、高温和去污剂的共同作用下，植物细胞破裂，DNA从细胞核释放到提取缓冲液中。经蛋白质强变性剂处理结合离心，除去蛋白质和色素等杂质，再用乙醇沉淀便可获得高纯度的DNA。
DNA电泳是依据DNA带负电荷，而不同浓度的琼脂糖凝胶孔径大小不同，在外加电场的作用下DNA由负极向正极移动，分子量小的移动快而分子量大的移动慢，最终达到不同分子量大小的DNA分离的目的。
三、主要仪器及试材
水浴锅、离心机、移液枪、研钵、离心管、核酸电泳系统等；新鲜健康植物叶片，液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤 1.药品的配制: CTAB提取液：
(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇，混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）：
重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。2.DNA的粗提
在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用尖头玻棒将材料研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000 rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000 rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000 rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。3.DNA的纯化：
向风干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小时，然后加入700 µl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700 µl氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 –12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 µl 5M NaCl，再加入1 ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小时后换一次，后浸泡过夜，8000 rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100 µl TE充分溶解备用。
4、DNA检测
（1）取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7
（3）向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5 U/µg DNA，37℃消化过夜，用0.5×TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。
五、实验注意事项
1、实验中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危险或有毒物质，操作时要戴手套，并在专门区域操作。
2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。
六、思考题
简述DAN提取的步骤及主要试剂的作用。
主要参考文献
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验四 质粒DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
三、主要仪器及试材
含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。
液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制:
1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。
2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。
4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。
5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。
7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。
8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。
10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。
11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。
14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。
（二）实验步骤
1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。
2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。
3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。
4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。
5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。
7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。
8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。
9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。
10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。
五、实验注意事项
1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。
2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。
3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。
六、思考题
简述质粒DAN提取的步骤。
主要参考文献
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。
实验五 PCR技术
一、实验目的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。
二、实验原理
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、主要仪器及试材
含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。
四、实验方法与步骤
1、调整模板浓度至5ng/ul。
2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。
Template DNA
2ul（20ng）10×buffer
2.0ul MgCl2（25mM）
1.5ul Primer F（10uM）
0.2ul Primer R（10uM）
0.2ul dNTPs（2mM）
2.0ul Taq（5U/ul）
0.2ul Add ddH2O to
20ul3、PCR反应循环条件设置：
95℃
3min
1cycle 94℃
1min
55℃
1min 72℃
90s
35cycles 72℃
10min
1cycle 4℃
forever4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳
5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验注意事项
1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；
2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；
3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；
4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。
六、思考题
简述PCR技术的原理和步骤。
主要参考文献
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料
实验六 PCR产物的TA克隆
一、实验目的采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果树上常用的分子克隆方法。相对于粘性末端来说，克隆具有平末端的双链PCR产物效率较低。目前，有两种方法可以采用，一种是在特异引物设计时引入酶切位点，另一种是TA克隆。通过本实验应掌握PCR产物TA克隆的原理，学习PCR产物纯化及回收，以及PCR产物与TA克隆载体的连接。
二、实验原理
TA克隆是利用耐热聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校准活性，即在PCR产物的两个3’末端加上未配对的单一A凸出尾，质粒载体提供线性3’末端单一的T凸出尾，使该载体能够直接与PCR产物高效连接。TA克隆技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。
三、主要仪器及试材
PCR扩增产物、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Promega公司）、pMD18-T载体（TaKaRa公司）以及感受态大肠杆菌、高速冷冻离心机、移液枪、琼脂糖凝胶电泳等相关仪器及试剂。
四、实验方法与步骤
1、PCR扩增片段纯化回收
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒收集PCR扩增产物，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行。
2、连接反应 反应体系组成pMD18-T
0.5-1.0 ul PCR fragment
1.0-4.5 ul ddH2O
0-3.0 ul Ligation Solution I
5.0 ul 混合后，置于室温下放置数小时或过夜连接。
3、重组子转化（热激法）
1）在含适当浓度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；
2）冰上冷冻新灭菌的1.5 ml 离心管； 3）取出感受态大肠杆菌，冰上放置冻融；
4）取新灭菌的1.5 ml 离心管，加入50 ul感受态细胞和10 ul连接反应液，用移液枪轻轻吸打均匀，在冰上放置30 min；
5）热激：将离心管在42 ℃下水浴90秒钟。请勿摇动离心管； 6）冰镇：快速将离心管转移至冰浴，1-2分钟；
7）复苏：每管加400 ul液体LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均匀涂布于“1）”已制备好的LB平板上；
9）培养：在37 ℃下倒置培养12-16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子。转化子可以在4 ℃下保持1个月；
10）单菌落培养：用灭菌的牙签，挑选白色的单菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液体LB培养基的50 ml离心管中，在37 ℃摇床上培养过夜（12-16 h）。
4、质粒DNA的分离 参考有关文献。
5、检测
采用相同的引物对进行PCR再扩增，或质粒上根据插入片段两端的酶切位点而进行限制性酶切，通过电泳可以检测出片段是否克隆成功。
五、实验注意事项
1、连接温度不宜太高，连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率；
2、热激过程注意勿摇动离心管。
六、思考题
简述PCR产物TA克隆的原理和步骤。
主要参考文献
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料。
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器一、实验目的实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。......
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