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PCR技术及其应用实例和前景
检验0905郭媛媛
PCR是我们研究 分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。
摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。
关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言
人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。
20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的PCR技术。2 PCR技术原理
下面我通过摘录了一个实验[2]，来介绍一下PCR技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。.在94°C高温下双链变性，分离出DNA单链的模板，然后降温(55°C)，然添加的与DNA单链配对，紧接着温度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板DNA被大量复制。
在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方：
(1)在配置PCR反映体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后加入，因为有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反应较强，反映体系如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。
(2)非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。
以上实验可清楚明了地向我们展示PCR技术的原理。3 PCR技术分类
PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历了20年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的PCR技术[3] 3.1反转录PCR 反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子为模板的扩增技术，主要用于克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针机构建RNA高效转录系统。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种PCR产物之间的数量关系。另外定量PCR还有广义和狭义之分[4]，在此就不详细介绍了。3.3实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。3.4重组PCR 重组PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同的碱基。利用重组PCR可造成DNA片段的碱基插入或缺失，从而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是对一个已知的DNA片断序列两侧的未知序列进行扩增和研究的技术。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。多重PCR可同时检测多个突变位点或病原生物，有利于遗传病和感染性疾病的诊断。3.7不对称PCR 不对称PCR(asymmetric PCR)即在扩增体系中加入不同浓度的引物，而得到单链DNA产物。
另外还有几种新型的、最近兴起的PCR技术[5]，虽不十分成熟，但发展前景十分广阔。它们包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指对组织细胞中特异DNA或RNA进行PCR扩增，然后再用原位PCR进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。目前有报道[6]用这种方法可检测出组织细胞中的人乳头瘤病毒、艾滋病毒、结核杆菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常规PCR灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性。所以这种方法用于临床检验，目前血清中丙型肝炎的监测多用这种方法。
4.PCR技术应用实例
PCR技术自从建立以来，由于其敏感、高效、操作简便，在分子生物学研究、临床医学和其他很多领域中得到4.1分子生物学理论研究[7] 如：制备cDNA文库与筛选，要较多的组织。但如果用PCR技甚至几个细胞就可以构建cDNA高了工作效率。
再如：DNA测序、检测突变碱基、基因重组与融合、用简并引物法扩增未知序列，无不是PCR技术在分子生物学中的应用。4.2临床医学[8]
如：病原体诊断，利用PCR技术可以检测标本中的病毒、细菌、支原体，直至寄生虫等病原生物，标本可以是组织、血液、细胞、分泌物、排泄物等。以后还发展了遗传病基因的诊断、组织器官移植的配型选择、肿瘤的诊断转移和确定、法医学和其他临床医学领域。4.3考古学[9]
由于PCR技术对基因组的完整性要求不高，因而对分子考古学极为有帮助，科判定生物种类间的亲缘关系、进化途径等。
如：1997年德国慕尼黑大学动物研究所科学家宣称[10]，他们对欧洲原始人——欧洲尼安德特人化石中的基因残余物进行分析，结果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实，为现代人的起源提供了新的论据。4.4 其他领域
PCR技术还在动植物研究领域、组织和群体生物学等领域已得到了广泛的应用[11]。5.前景与总结
结合对以上PCR技术的了解，我认为PCR技术可以加快实现它的工程化，效
既费钱费时，又需术，只要很少组织文库，并且大大提了广泛应用。益化，如：应用在现代环境工程污水处理工程的微生物载体研究上[12]，PCR技术暂时只是致力于理论方面和研究方面，它并没有像其他微生物技术那样给人类社会带来大规模的经济效益，假如可以实现这一设想，那么不但PCR技术本身可以得到更加快速的发展，而且我们还可以促进经济的发展。
比如说：在传统的生物发酵技术上可以结合PCR技术，利用DNA在体外的复制和杂交，并实现表达，可以实现基因工程的超远缘杂交的物种突破难进行的问题；再比如：可以通过PCR技术实现核酸杂交技术，核酸杂交法比抗原捕获特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，目前国内外常用的生物素检测标本中致癌物质[13]。
另外，还有很多微生物的PCR技术在工程上的应用，这里就不一一列举了。关键是怎样扩大在工程上的应用，以扩大经济效益。这是PCR技术的关键。
PCR技术运用传统生物技术结合近代基因工程原理，包含反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术、多重PCR技术、不对称PCR技术等多种传统PCR技术和原位PCR技术、巢式PCR技术等一系列新兴PCR技术。最新的进展如[14]：结核杆菌诊断PCR；病毒学PCR技术；HIV感染PCR；检测人COX病；DMS/BMD基因；地中海贫血PCR；血友病A基因„
在工业在分子生物学、临床医学、考古学等众多领域取得了巨大成就，不但只是局限于研究领域，而且还从实用角度证明了PCR技术是一项令人类值得自傲的技术。自从1985年由Millus创立之后，又得到了近二十年的发展，所以PCR技术的发展前景是不可估量的。它绝对是现代生物学技术中一项值得发展的技术，在当今社会乃至未来社会都会有它的立足之地，充分运用它，人类会在文明发展的进程中，发出更耀眼的光芒。参考文献：
[1] 欧阳平凯,《》生物科技辞典,化学工业出版社,北京,2003.10:342 [2] 赵斌,何怡红,《微生物实验》,科学出版社,北京,2002,23(5):11-15 [3] 孙汶生,黄英才,马曹红等,《基因工程学》,科学出版社,北京,2004.8:131-136 [4] 魏平著,《关于定量PCR技术》,科学教育出版社,北京,2001.815:59 [5] 贺淹才,《简明基因工程原理(第二版)),科学出版社,北京,2005,8:175-197 [6] 俞华,《PCR技术发展及应用前景》,人民日报,2003.12(5),第7版 [7] 马中声等,《分子生物学》,教育出版社,北京,2004,7:135 [8] 陆德如等,《现代生物医学技术》,化学工业出版社,北京,2002,7:50-52 [9] 李立家,《PCR技术的应用及前景》,东北大学学报,2002,11:10-15 [10] Geoger White,《 Prospective of PCR Technology》, Science,2000,5(7):29-32
[11] Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“《Quantitative PCR Protocols》” Edited by: B.kochanowski and V.Reischi, Humana pre Inc.Totowa, NJ, 1999
[12] 李彦春,《关于废水处理的现代技术应用》,环境技术通报,2005,5(4):25-30 [13] 二雄吉平,吴涛译,《关于PCR技术的一些看法》,东京大学学报现代基因技术译丛, 2004,11(4):10-15
[14] Te.M.Jiion etc.《Toward routine diagnosis of hepatitis B virus desoxyribonucleic acid》.Clinical Biochemistry, 1993, 26:289.
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