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基因工程在废水处理中的应用状况及展望
摘要：本文对现代基因工程技术在污水生物处理系统中的应用进行了概述, 利用基因工程技术提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术。笔者就基因工程技术的原理、研究内容和在污水处理领域中的应用进行了阐述了，并对其研究方向作了展望。
关键字：基因工程，污水处理，应用
The application status of gene engineering technique to wastewater
treatment and its prospects
Abstract: The application of gene engineering technique in wastewater treatment proce had been discued in this paper, and gene engineering technique was the key technique for wastewater treatment by improving the purifying environment ability of microbes.The author formulated the principle, main research content of gene engineering technique, and the application of gene engineering technique in wastewater treatment, and discued its research orientation in the end.Key words: gene engineering, wastewater treatment, application
生物法处理生活污水如今已被广泛的应用，但揭示污水中复杂微生态系统方面存在很大的局限性，并且有些特殊污水用自然界中自然进化的微生物难于降解，基因工程的引进开辟了培育高降解能力的新品菌种方法，利用基因工程技术检测微生物性状、提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术。基因工程的定义
基因工程（genetic engineering）是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。（3）外源基因的导入。（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。（5）外源基因表达产物的生理功能的核实。（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析。（7）生态与进化安全保障机制的建立。（8）消费安全评价。基因工程技术在废水处理中的应用
环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。尤其是在污水处理方面，生物法逐渐成为废水处理的主要方法。但是由于废水的多样性及其成分的复杂性，自然进化的微生物降解污染物的酶活性往往有限。20世纪90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，就可以定向获得具有特殊降解性状的高效菌株，方便有效地应用于水污染处理。因此，构建基因工程菌成为现代废水处理技术的一个重要研究方向，且日益受到人们的重视。
2.1 基因工程技术在污水检测中的应用
2.1.1 聚合酶链反应(PCR)技术在污水检测中的应用
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数(通常为25~30个循环)，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。这种技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。PCR技术的基础是只有在微生物特定核酸存在的条件下，重复性酶促DNA合成和扩增才能够发生。PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来检验和纯化，也可以被用来克隆、转化和测序.在具体应用中往往采用经过修正的或与其它技术联合应用的PCR衍生技术，如RT-PCR、竞争PCR、PCR-DGGE、PCR-SSCP和巢式PCR等。
PCR通过对待测DNA片段的特异性扩增，一方面作为菌株定性鉴定的重要手段，同时也为定性和定量研究微生物的群落特征提供帮助。自PCR技术问世以来，通过其自身的不断完善以及同其它相关技术的联用，在污水生物处理微生物的检测和鉴定方面得到了长足的发展，为该领域的研究提供了一个高效、灵敏、简便的研究工具。应用PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrphoreses)方法对环境微生物进行研究可以不经过培养，直接从样品中提取细菌的DNA，再将编码有16SrDNA的基因进行扩增。通过这种方法能够直接了解样品中微生物分布结构，并能大致比较相同条件下单一菌群的生物量。王峰等采用PCR-DGGE技术来分析活性污泥与生物膜中微生物种群的结构，可以不经过常规培养而直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA；Marsh等利用PCR-DGGE分析并获得了活性污泥中真核微生物的种群变化情况；Nicolaisen等利用PCR-DGGE技术发现Nitrosomonas-like细菌是上流式好氧流化床颗粒污泥中的主要氨氧化菌。以上的事实均说明，PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的适于环境样品微生物研究的快速分析方法。
2.1.2 荧光原位杂交技术(FISH)技术在污水检测中的应用
荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，能够在自然的微生物环境中检测和鉴定不同的微生物个体，并提供污水处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。FISH技术的基本原理是通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测。
Nielsen等(2001)对工业废水处理厂活性污泥的细菌表面疏水性进行了原位检测，并应用FISH技术结合细胞表面微球体分析研究了丝状细菌的胞外聚合物。Konuma等(2001)运用FISH法来测定氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria)的数量，结果表明，FISH法对氨氮含量高的活性污泥混合液检测结果较好，但对氨氮含量低的污水厂出水和河水的检测效果不佳。表1列举了FISH技术的一些应用实例。
表1 FISH技术在废水中微生物检测的具体应用实例
Table1 The applications of FISHin the microorganism detections in wastewater 应用
检测活化污泥反应器中的Microthrix parvicella 在EBPR系统中,考察聚磷菌(PAOs)的微
生物特性和生化特性
探明废水处理湿地生物膜中影响氨氧化的主要功能菌群
揭示UASB反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生物群落的空间分布和多样性 鉴定了活性污泥中硝化细菌群落的数量和空间分布
SBR反应器内,不同电子受体条件下,反 硝化除磷菌(DNPAOs)的种群变化
文献来源（Eberlet al.,1997)(Minoet al.,1998)(Silyn-Robertset al.,2001)(Sekiguchiet al.,2002;Syutsuboet al.,2001)(Coskuneret al.,2002)(Johuanet al.,2002)
2.1.3 DNA重组技术在污水检测中的应用
DNA重组技术的实质是，将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。其基本程序是:外源DNA的获得；选择载体并进行处理；将目的DNA片段和处理后的载体连接；将连接产物导入合适的宿主细胞内，使重组DNA分子在宿主细胞内复制扩增；将转化菌落在平板培养基上培养成单个菌落，筛选获得含有重组DNA的阳性克隆。在废水的处理过程中仅靠分离和筛选的功能性微生物是不够的。在混合的微生物群体中筛选特定的微生物菌种时往往得不到预期的结果；特定的微生物可能难以培养，从而无法应用到实际的生物反应器中；人类排放到环境中的污染物越来越复杂且难以处理。因此，有必要通过基因工程技术并根据具体的需要构建有效的基因工程菌或培育出可高效降解复杂多样的有害污染物的细菌来解决以上的问题。
2.2 利用基因工程菌降解废水中的有机污染物
生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法，但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解,这无疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程,对细菌来说这是一种不经济的营养方式；其次,某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用；此外,将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组,把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力。
Satoshi Soda等[11]将基因工程菌P.putidaBH(pSl0-45)接种到SBR反应器的活性污泥中,用于处理500mg/L的苯酚废水,在大大提高苯酚去除率的同时改善了污泥沉降性能。南京大学、扬子石油化工有限责任公司、香港大学、国家环保总局南京环境科学研究所联合完成了跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的生物工程技术。在优化调控技术的基础上,该菌株对二甲苯、苯甲酸、邻苯二甲酸、4-羧基苯甲醛和对苯二甲酸的降解率分别高达86%、94%、99%、97%和94%,比原工艺提高了20%～30%,总有机碳去除率达到了94%；污水经过处理后,铜、锰、锌、硒的浓度符合国家规定排放标准,生物毒性明显降低。
刘春等以生活污水为共基质,考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反应器中对阿特拉津的生物强化处理效果,以及生物强化处理对污泥性状的影响。结果表明,基因工程菌在MBR中对阿特拉津具有很好的生物强化处理效果,阿特拉津平均出水浓度为0.84 mg/L,平均去除率为95%,最大去除负荷可以达到70mg/(L·d)。生物强化的MBR对生活污水中COD的平均去除率为71%,COD平均出水浓度65mg/L。
吕萍萍等研究发现，克隆有苯降解过程中的关键基因——甲苯加双氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度,应用于固定化细胞反应器中效果突出。在较短的水力停留时间内,可以将1500mg/L苯降解70%,降解速度为1.11mg/(L·s),延长水力停留时间,可以使去除率达到95%以上。该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。同时所得到的产物为环己二烯双醇,可以被野生非高效菌W3快速利用。
2.3 基因工程技术在处理重金属废水中的应用
将基因工程技术应用于重金属废水的治理，就是通过转基因技术，将外援基因转入到微生物细胞中进行表达，使之表现出一些野生菌没有的优良的遗传性状。2.3.1基因工程菌强化生物化学法处理重金属废水
生物化学法指通过微生物处理含重金属废水,将可溶性离子转化为不溶性化合物而去除。硫酸盐生物还原法是一种典型生物化学法,该法是在厌氧条件下硫酸盐还原菌通过异化的硫酸盐还原作用,将硫酸盐还原成H2S,重金属离子和H2S反应生成溶解度很低的金属硫化物沉淀而被去除,同时H2SO4的还原作用可将SO2-4转化为S2-而使废水的pH值升高,从而形成重金属的氢氧化物而沉淀。中国科学院成都生物研究所从电镀污泥、废水及下水道铁管内分离筛选出35株菌株,从中获得高效净化Cr(VI)复合功能菌。
袁建军等利用构建的高选择型基因工程菌生物富集模拟电解废水中的汞离子,发现电解废水中其他组分的存在可以增大重组菌富集汞离子的作用速率,且该基因工程菌能在很宽的pH范围内有效地富集汞。但高浓度的重金属废水对微生物毒性大,故此法有一定的局限性,不过,可以通过遗传工程、驯化或构造出具有特殊功能的菌株,微生物处理重金属废水一定具有十分良好的应用前景。2.3.2 基因工程强化生物絮凝法处理重金属废水
生物絮凝法是利用微生物或微生物产生的具有絮凝能力的代谢物进行絮凝沉淀的一种除污方法。生物絮凝剂又称第三代絮凝剂，是带电荷的生物大分子，主要有蛋白质、黏多糖、纤维素和核糖等。目前普遍接受的絮凝机理是离子键、氢键结合学说。前述硅酸盐细菌处理重金属废水可能的机理之一就是生物絮凝作用。目前对于硅酸盐细菌絮凝法的应用研究已有很多[，有些已取得显著成果[7]。运用基因工程技术，在菌体中表达金属结合蛋白分离后，再固定到某些惰性载体表面，可获得高富集容量絮凝剂。
Mehran Pazirandeh等人将含金属结合肽(Cys．Gly．Cys—Cys．GIy)的基因与麦芽糖结合蛋白的基因进行融合，并将融合蛋白在E．coli细胞膜处表达，表达该融合蛋白的基因工程菌对人工合成废水中Cdz+和H +的去除率有很大的提高，Cdz 和H +的富集能力分别达到每毫克湿细胞1．1和1．3nmol，而对照菌株(缺少金属结合肽)的富集能力低于每毫克湿细胞0．1 nmol Masaaki Terashima 等利用转基因技术使 E.coli表达麦芽糖结合蛋白（pmal）与人金属硫蛋白（MT）的融合蛋白pmal-Ml并将纯化的 pmal-MT 固定在Chitopeara 树脂上，研究其对 Ca2+和 Ga2+的吸附特性，该固定了融合蛋白的树脂具有较强的稳定性，并且其吸附能力较纯树脂提高十倍以上。展望
自2000年，国际上提出基于系统生物学原理的基因工程概念后，基因工程被应用于社会各个领域，并且手段日新月异。在环境领域当中，基因工程正迅速应用到废水检测和废水治理当中，培养出新的特效物种并进一步提高其应用效率、降低应用成本。随着分子生物学技术、环境工程检测技术的发展并结合我们已经掌握的微生物群落结构和功能方面的知识,我们逐渐了解到污水生物处理系统中微生物群体的多样性、实际生存状态、功能特点,并更有效地对其加以开发和利用。此外，基因工程菌的出现，使以往的一些难降解有机废水、制药废水、石油废水、重金属污染废水以及其他有毒有害废水等都得到了有效地治理，还会实现废水资源化。当下引入DNA 扩增和其它生物技术的环境监测方法等将是基因工程技术研究的侧重方向。
基因工程技术作为一种新兴技术以极快的速度发展。以下两方面的研究将对水资源保护有着重要意义。一是对基因工程菌的深入研究,如基因工程菌对污染物的代谢途径、控制目的基因表达的启动子基因序列、降解基因表达的调控条件的优化等方面的研究；二是对环境中微生物的习性及基因工程菌与环境中微生物和污染物之间的相互作用进行研究。目前的研究主要是利用单一的基因工程菌对污染物进行处理,随着研究的不断深入,利用多种基因工程菌相结合对污染物进行处理,将对水资源保护起到更为重要的作用。参考文献
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