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自制抗-HIV临界值质控血清的室内质控及评价
韩光宇
徐州市医学科学研究所医院
前言
艾滋病（获得性免疫缺陷综合征，AIDS）是严重危害人类健康和生命安全的重大传染病，自1981年6月美国CDC首次报道了艾滋病以来便迅速在全球范围蔓延，目前已有150个以上国家发生本病。1983~1984年，先后由法国巴斯德研究所的Montagnier、美国国立卫生研究院国立癌症研究所的Gallo和加州大学实验室的Levy分别从不同的艾滋病病人分离出同一种病毒，由国际病毒分类委员会与1983年统一命名为人免疫缺陷病毒（HIV），也称为艾滋病病毒。
现状分析
1985年我国发现了首例输入性艾滋病病例，1989年发现了经性途径感染HIV的国内感染者，同年从注射毒品者中发现HIV感染者，1995年发现经母婴途径传播的HIV感染，至此三种传播途径均在我国出现。艾滋病在我国的传播经历了三个阶段，即传入期(1985～1988年)，共有7个省报告HIV和AIDS，主要为外国人或海外华人传入病例及应用进口血制品而被感染者且主要分布于沿海大城市；扩散期(1989-1993)，HIV/AIDS扩散到21个省，大多数HIV/AIDS发现在沿海省和大城市，在云南发现注射毒品者中感染HIV；增长期(1994-现在)，31个省级区划均报告发现了HIV/AIDS。近年来，我国艾滋病疫情、发病和死亡人数明显上升，感染范围广，呈现出全国低流行，局部高流行的特点。传播模式暨途径发生变化，疫情由高危人群向一般人群扩散。截至2010年10月底，卫生部通报累计报告艾滋病病毒感染者和病人37万余例，其中病人13万余例，死亡6.8万余例[1]。而实际数字可能远不止这些。因此艾滋病检测实验室遍布全国各医疗机构，抗体（抗-HIV）初筛检查成为出入境检验检疫、采供血、妇幼保健、手术前及征兵体检等常规检查的项目。
问题确立
检测HIV抗体是艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制HIV 传播和控制艾滋病流行的重要手段。目前艾滋病初筛实验室多用酶联免疫吸附实验（ELISA）作为常规的检测方法，可快速检测艾滋病毒抗体。由于ELISA方法易受多种因
素影响，有系统误差（包括试剂质量、移液器与酶标仪读数的准确性、冰箱水浴箱温度的波动及环境温度等）和随机误差（工作人员操作因素等）。因此在ELISA检测时需设内部对照质控血清及外部对照质控血清进行有效监控。内部对照血清即试剂盒提供的阳性和阴性对照血清，它是质量控制的基础，每一次检测都必须使用内部对照质控血清且只能在同批号的试剂盒中使用。而为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异必须设置外部对照质控血清以加强室内质控，抗-HIV检测亦不例外。为加强抗-HIV检测工作的质量控制，确保检测结果的准确性和可靠性，尤其是防止弱阳性标本漏检，应设置弱阳性质控血清（又称临界值质控血清），以临界值质控血清的吸光度值为该试剂盒临界值（Cut-off）的23倍（即S/CO=2~3）为宜。
目的因卫生部临检中心抗-HIV临界值质控血清价格较贵，制备抗-HIV临界值质控血清，以加强抗-HIV检测的质量控制。
文献查证
国内多家抗-HIV初筛实验室制备了临界值质控血清，取得了很好的效果[2-4]。解决方法
以正常人阴性血清稀释抗-HIV试剂盒自身阳性对照质控血清制备抗-HIV临界值质控血清，进行室内质控。
执行过程
1收集临床多个无溶血、无脂浊、无黄疸、无细菌污染及其它传染性指标的经抗-HIV检测阴性的正常人血清充分混匀，56℃、30min灭活，3000r/min离心15min，去除沉淀物备用。收集厦门英科新创抗-HIV试剂多批号阳性对照质控血清，充分混匀，用上述正常人血清按1:
2、1:
4、1:
8、1:
16、1:
32、1:64倍比稀释，按照试剂盒说明书操作，每个稀释度测定3孔，取其平均值，查找其线性范围，并以S/CO约为2.5（2~3之间）的稀释梯度配制临界值质控血清，按1年使用量配制，加入0.01%硫柳汞防腐，无菌分装至多个0.5ml的Eppdorf管，-20℃冷冻保存备用。质控血清的使用方法 检测前取出冰冻质控血清1支，自然融化，平衡至室温充分混匀，与临床标本及阴、阳性对照一同严格按试剂盒说明书进行操作。
用后及时4℃冷藏，不可反复冻融。由于质控血清含量较低，效价不易保持，因此融化后只使用一周即弃去。
结果评价
1质控血清均匀性测定
随机抽取10支质控血清融化，在同一块板上测定，每支重复测定2孔，取平均值，计算各支质控血清S/CO的管间差异，得出其均值x=2.47，标准差s=0.23，变异系数CV=9.27%。具体结果见表1（其S/CO值按大小顺序排列），表明分装的各支质控血清是均匀的，管间差异符合要求。
表1.质控血清均匀性测定结果
S/CO 1 2.11 2 2.232.282.392.472.512.562.612.722.86 2 批内精密度测定
在同一块板上，用质控血清重复测定20孔，计算其均值x=2.51，标准差s=0.31，变异系数CV=12.36%，结果见表2（其S/CO值按大小顺序排列），表明制备临界值质控血清精密度符合要求。
表2 质控血清批内精密度测定结果
S/CO
S/CO 11 2.51 12 2.572.642.662.712.722.872.882.963.12 1 1.98 2 2.092.132.172.222.342.392.412.432.48 3 室内质控方法
3.1绘制质控图 由于抗-HIV检测的特殊性，并不是每天都做检测，因此连续测定20天每天一个数据用于绘制质控图存在困难，参照全国艾滋病检测技术规范[5]，用一周时间（5个工作日）每天做一次检测，每次重复4孔，共20个数据计算平均值、标准差及变异系数，以S/CO值为纵坐标，以日期和次数为横坐标，建立以x为中心线，以x±2s为警告线，x±3s为控制线，作为实验室该批号试剂质控框架图。
3.2以后每次检测时，取质控血清与标本一同检测，计算S/CO值，点在质
控图上，如果该点落在x±2s范围之内，本次实验有效，可发出报告。如果该点落在x±2s以外，则认为本次实验存在显著误差，及时分析误差原因，尤其应警惕临界值标本，分析原因后重复本次实验。在一批试剂盒用完之后，将各个质控点用线连接起来即成为一个质控图。质控血清稳定性观察
由于抗-HIV试剂盒的有效期一般为一年，以质控框架图为基准，观察连续12个月，计算每月质控血清S/CO的均值(x)，标准差(s)及变异系数(CV)，结果见表3，表明质控血清在冰冻状态下可保存一年。
表3.质控血清每月S/CO的x、s、CV的变化
x 1 2.52 0.32 2 2.59 0.32 3 2.43 0.29 11.9
2.49 0.34
2.72 0.34
2.53 0.31
2.39 0.32
2.58 0.30
2.61 0.36
2.51 0.35
2.46 0.31
2.39 0.33 s CV 12.69 12.36 13.65 12.50 12.25 13.39 11.63 13.79 13.94 12.60 13.80 结论
近年来，随着艾滋病感染者不断增加、感染人群的变化和临床病人的日益增多，抗-HIV的初筛检查日益重要。ELISA检测抗-HIV是国际上应用最早、发展最快，至今仍是HIV初筛实验室使用最广泛的检测技术，因此提高抗-HIV检测的准确性十分必要。除做好内部对照外，应建立外部质控，2009年9月我们实验室通过用正常人阴性血清稀释试剂盒阳性对照血清制备的临界值质控血清，使用一年，稳定性和精密度符合要求，可有效监测实验的准确性和可靠性，取得了满意的效果。
参考资料
[1] 我国艾滋病防治工作取得显著成效[S]．北京：中华人民共和国卫生部新闻办，2010-11-29．
[2] 王莉．艾滋病抗体检测室内质控血清的制备和应用[J]．河南医药信息，2003，24（2）：62-63．
[3] 何芳，马真真．初筛实验室抗-HIV临界值质控血清的制备及应用[J]．现代检验医学杂志，2007，22（5）：119-120．
[4] 张桂芳，韩学文，杨世强．HIV抗体弱阳性外部对照质控血清的制备及应用[J]．检验医学，2007，22（6）：683-687．
[5] 全国艾滋病检测技术规范[S]．2004年版，北京：中国疾病预防控制中心，2004．
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